表皮生长因子的国内外研究与应用情况综述
表皮生长因子的国内外研究与应用情况综述
李黄金 涂桂洪
（深圳市华生元基因工程发展有限公司技术中心 518057）
前言
传染性和神经营养性角膜炎、化学伤及各类角膜手术均可引起角膜上皮层、基质层和内皮层等组织的严重损伤，并导致永久性和复发性角膜糜烂与缺损，但目前尚缺少有效的促损伤角膜愈合的药物和处理手段。表皮生长因子（epidermal growth factor , EGF）是一类广泛存在于人和动物体内的细胞因子，可促进多类细胞的分裂、分化和移行。国内外大量研究业已表明，EGF可显著加快角膜上皮重建速度、刺激内皮细胞增殖与移行、增加角膜创面抗张强度，因此，在治疗各种原因引起的角膜上皮损伤和内皮缺损及提高各类角膜手术的术后愈合速度和愈合质量方面具有广泛应用前景。
本公司自主研究开发的重组人表皮生长因子衍生物已被作为国家一类新生物制品批准用于体表烧伤、创伤和溃疡的治疗，在相关研究和应用领域积累了一定的经验、并具有成熟的生产工艺和良好的软、硬条件（企业已通过国家GMP认证），因此，将重组人表皮生长因子衍生物进一步开发成滴眼剂。
一、国内外研究现状
EGF由Cohen博士于1960年代发现，有关EGF与角膜创伤修复的临床前研究主要集中在80年代中后期至90年代初期，直至目前，日本、意大利和西班牙等国均已进行了相关的人体试验，并取得了令人满意的疗效，现将国内外有关EGF与角膜损伤修复的研究综述如下：
1．人眼中的hEGF及hEGF受体
Wilson SE等[1]发现人的泪腺可合成hEGF的mRNA，而一些研究[2—5]则表明人的泪液和眼房水中存在hEGF。因此，hEGF属人眼的天然产物，且由泪腺合成后通过外分泌途径分泌于泪液中。EGF作用于靶细胞时，首先必须与细胞表面特异性受体结合[6—8]，而hEGF的特异性受体则广泛存在于角膜上皮细胞[6—8]、基质角化细胞和内皮细胞[9]中，且当角膜上皮和基质细胞受损时，可引发EGF受体的合成[12]。因此，hEGF必然在维持角膜组织的完整性方面起重要作用。
2．关于EGF和角膜的体外研究
EGF与角膜上皮 众多体外研究[7—8，13—14]结果表明，EGF可促进动物和人的角膜上皮细胞的增殖。老鼠的EGF（m EGF）可促进离体兔子角膜上皮细胞的增殖及其DNA、RNA和蛋白质的合成[8]。Awata T等人[13]发现，0.1ug/ml的m EGF可促使离体兔子角膜上皮细胞的DNA和蛋白质合成增加64倍。在器官培养实验中，0.5、1.0和5.0ug/ml浓度的EGF可分别使13天龄鸡胚、小牛和人胎儿的培养角膜上皮增生[14—15]。当培养角膜致创后，EGF处理（50mg/ml）可明显促进角膜上皮创伤的愈合。而当加入可破坏微管结构、抑制细胞分裂的秋水仙素时，EGF 则不能加快创伤的愈合[6]。表明EGF不会增加创伤愈合初期所需细胞活力，但能通过诱导细胞的增殖来促进创面愈合。细胞附着因子为介导角膜上皮细胞粘合到基底层的一种粘性糖蛋白，在角膜受损后，细胞附着因子可促进上皮细胞的迁移与粘合[17]，EGF可刺激角膜基质角化细胞细胞附着因子的合成，但对上皮细胞无此作用[18]。
EGF与角膜基质 在单层培养的人角化细胞中，10pm浓度的EGF即可刺激DNA的合成[19、20]。地塞米松抑制DNA的合成、但对EGF刺激角化细胞分裂的活性没有影响[21]。如前所述，EGF可刺激角化细胞细胞附着因子的合成。因此，EGF可通过刺激角化细胞的增殖和为粘合上皮细胞所必需的细胞附着因子的合成来影响角膜创伤的愈合。
EGF与角膜内皮 Gospodarowicz D等人[22]的研究结果表明，h EGF可促进培养小牛角膜内皮细胞的增殖，内皮细胞数目倍增时间从48小时减到24小时。与用角化细胞所做实验一样，地塞米松不会影响EGF的促内皮细胞DNA合成作用[23]。另外，EGF可促进单层培养损伤内皮细胞的迁移[24]。在损伤角膜器官培养中，EGF可促进内皮细胞的迁移和减小创伤愈合时间[25—27]，并可刺激培养的人胚胎和成人角膜内皮细胞DNA的合成[20]。因此，EGF不仅可刺激内皮细胞DNA合成、促使内细胞进入分裂状态，而且可通过刺激内膜细胞的迁移来促进损伤内皮的修复。
3．关于EGF与角膜的动物活体研究
EGF与角膜上皮缺损 目前已有众多动物体内研究[8、14、28、33]结果一致表明，局部使用外源EGF可促进角膜上皮缺损的修复。m EGF可加快环割术和刮除术后的兔子角膜上皮创伤的愈合[14]。0.05mg/ml EGF 每天4次共处理7天可使损伤上皮修复，创伤开始愈合的比对照提前24小时。在另一体内试验[8]中，2mg/ml剂量的EGF 可使环割术造成的5mm大上皮中心创伤快速愈合，并可形成多层上皮细胞层。0.05、0.50和2.00mg/ml三种剂量EGF 处理间，上皮愈合速度和细胞层数差别不大。
在实验性角膜上皮重建模型[33]中，100mg/ml h EGF可使上皮创伤愈合速度比对照高出45%（分别为0.13和0.09mm/hr），且0.5mg/ml浓度时的效果与100mg/ml浓度的相近。重组h EGF与新地卡特隆协同局部给药时，可使灵长类动物角膜的上皮创伤修复速度加快，经组织学考察，再生组织完全正常，并无肥大或增生。且在整过实验时间内无任何免疫反应[32]。S期分析表明，h EGF可诱导损伤角膜的上皮细胞，特别是创伤周边区细胞的迅速增殖[31]。因此，外源EGF局部给药可诱导损伤角膜上皮周边细胞的增殖，提前上皮创伤开始愈合的时间和增大愈合速度，且不会引起组织肥大和增生。因而外源EGF局部药处理在治疗角膜上皮缺损和创伤方面有较大的临床价值。
EGF与角膜碱烧伤 在角膜碱烧伤动物实验模型中，10—100mg/ml hEGF处理32天可一致地使创伤愈合速度明显快于对照[33]。在另一些实验中，0.1N NaOH损伤角膜用mEGF处理3—4天后创伤面积减小，使碱烧伤面获得更大和更稳定的覆盖[36]，但已完全愈合的数不一[34，35]。EGF碱烧伤角膜的效果差异可能主要来源于碱烧伤程度和损伤情况的不一致。有些碱烧伤中，可能已伤及基底膜，并引起炎症而影响到上皮与基底膜的粘合。
EGF可诱导角膜基质增生和细胞增殖，以重建剥脱和变性的基质。但单独使用EGF并不能阻止复发性的糜烂，而当与细胞附着因子协同使用使时可加快碱烧伤角膜上皮的重建，并能阻止复发性糜烂[37]。角膜碱烧伤后常有角膜基质白细胞的渗入、类固醇则可减少基质白细胞的渗入，阻止胶原蛋白降解和减少角膜糜烂复发和角膜穿孔的机会[37]。因此，EGF与细胞附着因子及类固醇协同处理碱烧伤角膜，是加快上皮重建和阻止角膜糜烂复发和穿孔的较为适宜的方法，且在临床上具有巨大应用价值。
EGF与角膜上皮移植术 角膜上皮移植后，特别是对于老年人来讲，上皮再生常发生困难。10ug/ml剂量的h EGF局部处理，即可加快灵长类动物创伤处上皮的再生[35]。机械刮伤后的角膜上皮可被外源EGF处理加快再生速度，并使角化细胞和胶原蛋白含量增加30%。因此，外源EGF局部处理可用于角膜上皮移植后的上皮重建过程。
EGF与角膜创面抗张强度 角膜创伤愈合过程和愈合后的创面抗张强度是衡量创伤愈合情况的重要指标。外源EGF局部处理可增加兔子穿孔性切伤角膜创面的抗张强度[23、38]，且在0.01—0.1mg/ml浓度范围内呈现剂量依赖性。EGF处理可减少血纤维蛋白的产生和增加成纤维细胞数[39]。类固醇虽可减少胶原蛋白[40]和DNA[41]的合成和阻抑创伤愈合，但h EGF与皮质类固醇的协同局部给药处理可使灵长类动物切伤角膜创面的抗张强度增加，经组织学考察发现创伤处有1/3角膜深度的上皮细胞塞和新形成的胶原蛋白的存在[32]。因此，EGF可部份缓解皮质类固醇的抑制创伤愈合作用，而这对于穿孔性角膜移植和损伤后的创伤愈合方面是非常重要的。
EGF与穿孔性角膜移植 穿孔性角膜移植后，角膜必须在供体位置获得快速的再生，但这一过程在自然状态下常发生困难。在灵长类动物穿孔性角膜移植后，即刻向眼前房注入EGF可引起供体位置角膜上皮[42]和内皮细胞[43]的增殖，且当与胰岛素协同处理时可显著增强这一效果[44]。因此，外源EGF局部处理可应用于穿孔性角膜移植后的角膜再生。
EGF与放射性角膜切开术 EGF局部处理可加快放射性角膜切开术后的创伤愈合。用猫所做的实验[45]表明，放射性角膜切开术后，未用EGF处理的创伤处仅塞有一些上皮细胞和角化细胞；EGF处理组则无上皮细胞塞，但有成纤维细胞和胶原蛋白，且紧密地粘合在基膜上。
4．EGF局部处理角膜创伤的人体观察
Ganem S等[46]在一个随机双盲临床试验中，使用瑞士产的含EGF的PGZ对角膜上皮移植病人局部用药后，病人恢复时间（1—4天）比安慰剂处理组病人的（3—15天）明显要短，角膜上皮重建速度加快。Caporossi A等[47]进行的同类观察亦表明EGF局部给药处理可减少角膜上皮移植病人的上皮重建所需时间，加快上皮重建速度。
Danlele S等[48]在一开放性研究中，给三个因患神经营养性角膜炎引起的角膜上皮永久缺损的病人以EGF局部处理后，创面完全愈合。表明EGF在治疗因神经性角膜炎而引起的永久性上皮缺损方面具有较大的应用价值。
Pastor JC等[49]在5个中心对104个角膜病病人进行EGF局部处理时发现，EGF处理可使角膜创伤平均愈合时间明显减少，上皮创伤完全愈合数目比对照大得多，且病人对局部使用EGF滴眼剂有较好的耐受性。
因此，外源EGF局部用药处理在治疗各类角膜创伤方面的临床应用是可行的。
5.EGF局部用药的药代动力学
Chan ky等[52]曾考察了重组h EGF在活兔眼中及离体人眼中的药代动力学。现摘录如下：
1） 重组h EGF在活兔眼中 向兔眼房内注入1.2muci（1.1mg）125IhEGF后1、2、4和24小时时分析眼前房125IhEGF的吸收。在起初的4小时，hEGF半衰期在角膜中为 1.3±0.6hr（±置信界限在P=0.05），在虹膜中为0.7±0.4hr，在晶状体中为1.9±0.9hr，眼房水中为0.6±h（每种组织观察数为18）；在4—12小时间，hEGF在组织中的保持率（相对于各组织中的初始量）由大到小依次为：晶状体>角膜>虹膜>眼房水。
2）．重组hEGF在离体人眼中用1.2muic/ml（100ng/ml）125I hEGF在37℃或4℃下培养内皮层4小时。结果积聚在角膜中的hEGF（37℃下）为2.3±0.2ng（±为标准差，n=6）；4℃下为1.4±0.1ng。
二、重组hEGF处理角膜创伤的临床前评估
用途和适应症
根据EGF的生物学功能及其对各类角膜创伤影响方面体内外研究结果，我们可以将重组h EGF的用途和适应症归纳于以下几个方面：
1）．加快角膜上皮重建
① 用于难愈合性的角膜上皮缺损：传染性和神经营养性角膜炎、碱烧伤等引起的永久性和复发性角膜糜烂和缺损；
② 用于角膜上皮移植后（特别是老年人）；
③ 用于穿孔性角膜移植后；
④ 用于合成性角膜移植后。
2）．增加创面弹性强度
① 用于穿孔性角膜移植后；
② 用于放射性角膜切开术后；
③ 用于穿孔性角膜损伤；
④ 加强类固醇类药物疗效。
3）．提高创面稳定性
① 用于放射性角膜切开手术后；
② 用于角膜横切术后。
4）．促进内皮细胞分裂
① 用于进行性内皮细胞损失病人的角膜手术后；
② 用于角膜供体保护。
安全性评估
作为刺激细胞分裂和增殖的外源细胞生长因子用于局部处理角膜创伤前，必须解答下列问题，即是否引起强烈的免疫反应，是否引起角膜、结膜和晶状体视网等组织的不正常增生和血管增生等。
重组hEGF的编码DNA序列与人体内的同源，因此高纯度重组hEGF应不会在人体内引起强烈的免疫反应。特别是人眼中本来就存在hEGF及其受体，以及hEGF作用的内在“负调节”机制[10、11]，因此在理论上局部使用重组hEGF治疗角膜创伤是安全的，事实上一些体内实验已说明这一点。重组hEGF局部处理灵长类动物角膜创伤时，未发现任何免疫反应，再生组织完全正常，无肥大或增生现象[32]。一些人体观察试验[46—50]亦表明局部使用外源EGF角膜创伤没有引起任何不良反应。
在应用EGF局部处理角膜创伤时，一个较为敏感的问题是否会引起角膜血管增生。Taniguchi E等[51]曾为此考察过重组hEGF局部用药对角膜血管形成的影响。他们将不同浓度重组hEGF和bFGF（阳性对照）用EVA膜（一种缓释膜）通过手术植于兔子角膜基质中，经过5天和14天后切取角膜进行组织学考察。结果发现bFGF可明显引起角膜血管增生，而各种浓度重组hEGF处理的未发现有任何角膜血管增生。因此用重组hEGF局部处理角膜创伤并不会引起角膜血管增生。
关于EGF与癌方面的研究结果表明，只有在已发生癌变的组织才会对外源EGF处理发出“刺激”或“抑制”的应答反应，但不会引起正常细胞的转化［53、54］。我们所作的三致试验（未发表资料）也间接说明EGF无致癌性。
因此，高纯度重组hEGF局部处理角膜创伤时是安全可靠的。
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