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表皮生长因子治疗兔角膜碱性化学伤的药效学研究

发布时间:2006-12-05 00:00 点击:5711 字号:

重组人表皮生长因子衍生物滴眼剂
治疗兔角膜碱性化学伤的药效学研究
 中山医科大学   药理教研室
  中山医科大学  中山眼科中心
 
一、           试验目的
    观察重组人表皮生长因子衍生物滴眼剂对兔角膜碱性化学伤的治疗作用,明确其药效。
    眼部化学伤和其它原因造成的角膜伤是最常见和最严重的眼外伤之一,也是重要的致盲眼病,它的复明治疗是当今眼科界的棘手问题。人表皮生长因子(human Epidemic Growth Foctor , hEGF)是一种广泛存在于人体内的多肽生长因子,在角膜组织的上皮细胞和内皮细胞的膜表面均存在特异受体,因此在角膜组织功能完整性的维持和角膜创面修复方面必然起重要作用。深圳华生元基因工程有限公司采用先进的基因重组技术开发生产了hEGF衍生物,并拟开发成滴眼剂临床应用于外伤、手术、感染、化学等各种原因引起的角膜病的治疗,我们受该单位委托以兔角膜碱性化学伤动物模型为基础进行了有关hEGF衍生物滴眼剂的药效学研究。
二、材料
1. 药物
1.1    重组人表生长因子(human Epidemic Groth Foctor , hEGF)衍生物:由深圳市华生元基因工程发展有限公司提供,为无色透明液体,比活性为5×105 IU/mg,批号为990401。
1.2滴眼剂基质:由深圳市华生元基因工程发展有限公司提供,为无色透明液体,批号为991001。
1.3 素高捷疗眼膏( Solcosery Eye-Gel ):瑞士Soleo Basle Ltd 出产。
1.4  0.25%妥布霉素滴眼剂:中山医科大学中山眼科中心提供。
1.5  0.3%新霉素滴眼剂:中山医科大学中山眼科中心提供。
1.6  0.4%信诺喜( Banoxil ):日本参天制药株式会社出产。
1.7  3%戊巴比妥钠:英国进口分装。
1.8  2%荧光素钠:中山医科大学中山眼科中心提供。
1.9  NaOH:北京化二厂出产。
2. 动物
2.1纯种新西兰大白兔:体重2~2.5 kg,雌雄各半,由广东省卫生厅医用实验动物场提供,合格证号:991031
3. 仪器
3.1 裂隙灯:Topcon SL-7F(日本)
3.2 Konan 接触型角膜内皮细胞照相仪:LLASS  I  SERNO csp
580-RBN008(日本)
3.3 透射电镜:飞利浦L-10
3.4 滤纸8mm(用角膜环钻钻取)
3.5 Olimpus显微镜
三、实验方法
1. 角膜碱性化学伤动物模型的建立
    动物以20mg/kg戊巴比妥钠静脉麻醉,0.4%Benoxil滴眼液滴眼表面麻醉,开睑器开眼,取直径8mm的园形滤纸片浸泡在0.5 mol/L NaOH中,取出后除去多余NaOH,将浸有NaOH的滤纸片贴于大白兔角膜中央1分钟,然后用眼科用的平衡盐溶液反复冲去多余的NaOH。
2.试验方案
新西兰大白兔140只,雌雄各半,体重2.2±0.5 kg,分成5组,每组28只,其中3组为hEGF衍生物给药组,分别为低剂量组(2500IU/ml)、中剂量组(5000IU/ml)和高剂量组(10000IU/ml),另2组分别为阴性对照组和阳性对照组,滴眼剂基质作阴性对照,素高捷疗作阳性对照,各组均以一只眼为用药眼,另一只眼用平衡盐溶液作空白对照。
3.给药方法
    hEGF衍生物在无菌条件下以滴眼剂基质按规定的活性单位数稀释,以直接滴入眼结膜囊的方式给药,每日3次,每次2滴,连续给药二周。
4.观察指标与观察方法
4.1 上皮愈合面积和愈合率:角膜碱性化学伤后,用药前及伤后1、2、6、10和14天进行裂隙灯检查,荧光素染色照相,照片经计算机图像分析,计算角膜上皮愈合面积和角膜上皮愈合率。
角膜上皮愈合面积(mm2)= 给药前荧光素着色面积-给药后荧
                     光素着色面积
角膜上皮愈合率(%)=角膜上皮愈合面积÷给药前荧光素着色
                     面积
4.2  形态学检查:兔角膜碱性化学伤后, 滴用hEGF前, 滴药后1、2、6、10、14天处死3只动物,沿巩膜缘稍后取下角膜,对称分成二半个角膜,再分别进行光镜检查和电镜检查。
光镜检查标本制备:角膜用10%福尔马林固定,石腊包埋切片,然后HE染色,采用Olypmpus光学显微镜检查。
电镜标本制备:角膜用2.5%戊二醛-2%多聚甲醛混合液固定,浸洗后锇酸固定,各级递增浓度的丙酮酸脱水,Epon-812渗透包埋,半厚片定位后超薄切片,醋酸钠和柠檬酸钙双重染色,以H600型电镜观察。
3.3角膜内皮活细胞计数:3%戊巴比妥钠麻醉兔,6.4%Banoxil点眼行角膜表皮麻醉,充分暴露角膜,采用konan接触型角膜内皮细胞照相,测量角膜内皮活细胞数目,计算每mm2角膜内皮细胞的含量。
四、实验结果
1. hEGF衍生物对碱烧伤兔角膜上皮愈合的影响
在本研究建立的新西兰大白兔角膜碱烧伤模型中,设计的角膜烧伤面积约为50mm2。烧伤后,烧伤区内的角膜组织立即呈灰白色混浊,角膜上皮坏死脱落,周围组织虽透明,但已有轻微水肿。经荧光素染色和裂隙邓检查可见,各试验组角膜原烧伤区的着色区面积均为47mm2左右,自给药后角膜原烧伤区逐渐由外周向中央愈合, hEGF衍生物和素高捷疗治疗组至伤后第4天时均可见到原烧伤区角膜上皮完全愈合的兔眼,随后随着用药天数的增加,完全愈合的眼数亦增加,到第14天时低、中、高剂量hEGF衍生物滴眼剂组和阳性对照组完全愈合的兔眼分别达到50%、75%、75%和62.5%,而阴性对照组在整个观察期内均未见到完全愈合的眼(图1)。各试验组兔角膜在碱烧伤后不同时间点的上皮愈合面积和愈合率见表1。结果显示,在伤后第2天,hEGF衍生物滴眼剂三个剂量组的角膜上皮愈合率与阴性对照组(滴眼剂基质)相比即均已呈现了显著差异(P<0.05);至伤后第6天,各给药组的上皮愈合率已达到95%左右,而阴性对照组的仅为72%,差异显著水平达到P<0.01;在第6-10天间,各试验组的角膜上皮愈合率均有显著下降,这种现象可能与碱烧伤角膜上皮细胞的持续性脱落有关;至伤后第14天时,hEGF衍生物滴眼剂各剂量组的愈合率均回复到96%以上,与素高捷疗阳性对照组的(89.44%)形成,且二者之间差异显著(P<0.05)。因此,hEGF衍生物可减缓碱烧伤愈合过程中的角膜上皮细胞再脱落。结果表明,三种剂量的hEGF衍生物滴眼剂均可显著促进碱烧伤兔角膜上皮的愈合,且疗效明显好于素高捷疗。另外,hEGF衍生物滴眼剂的不同剂量组之间在角膜上皮愈合的前期(第1-4天)表现出较大的差异,见中、高剂量组的前期疗效好于低剂量组,表明hEGF衍生物治疗碱烧伤角膜时存在一定的量效关系。
病理组织形态学变化    正常兔角膜由上皮细胞层、前弹力层、基质层、后弹力层和内皮细胞层组成,上皮细胞层由5-6层细胞组成,排列规则。角膜碱烧伤后,上皮层完全脱落,前弹力层模糊,角膜基质暴露、水肿、增厚,凝固性坏死,内皮细胞面见纤维素性渗出及少数炎性细胞浸润;至伤后第14天, hEGF衍生物3种剂量治疗组的角膜原烧伤区已被5-6层上皮细胞覆盖,上皮细胞极向明显,细胞间连接紧密,前弹力层、基质层、后弹力层和内皮细胞层基本恢复正常;素高捷疗组大部分兔眼原烧伤区的角膜上皮细胞亦已有明显的增殖再生,但细胞层数不均一,见2-6层不等的上皮细胞,前弹力层尚模糊,角膜基质未见水肿;阴性对照组兔眼原烧伤区的角膜上皮细胞亦已有明显的增殖再生,但新生上皮层表面细胞部分脱落,大部分基质纤维变性和水肿(图2)。
 
 
2. hEGF衍生物对碱烧伤兔角膜内皮愈合的影响
一般认为,人的角膜内皮损伤后的修复主要依靠临近未受损的内皮细胞变形、移行及融合而完成,很少发生细胞分裂,因此,能否找到一种能促进人的角膜内皮细胞增殖的药物一直是眼科及药物界同道们努力的目标。不同组别不同给药时间点的角膜内皮细胞活体计数结果如表2。结果显示,碱烧伤可伤及角膜的内皮细胞层,因正常兔角膜内皮细胞密度约为2700细胞/mm2,而角膜烧伤区的内皮细胞密度仅为1900细胞/mm2左右。经治疗14天后,中、高剂量hEGF衍生物滴眼剂组的细胞密度已达到2400细胞/mm2以上,与阴性对照及阳性对照组形成显著差异(P<0.05)。结果表明,中、高剂量hEGF衍生物滴眼剂能明显地促进损伤的兔角膜内皮细胞的再生。
电镜下的内皮细胞形态学变化    将角膜原烧伤区的病理切片进行电镜观察可发现,在兔角膜碱烧伤后0天时,部分内皮细胞完全空胞化,部分内皮细胞虽然核膜完整,胞质内亦可见部分细胞器,但部分区域呈空泡化;至伤后第14天时,经中高剂量的hEGF衍生物治疗的兔角膜原烧伤区可见多层梭状内皮细胞紧密附着于后弹力层,细胞间连接紧密,胞膜完整,胞质内细胞器清楚完好,无水肿,粗面内质网和核糖体丰富,而未经治疗的角膜内皮细胞虽然可见胞内粗面内质网,但部分胞质区仍呈空胞化(图3)。结果表明,hEGF衍生物可促进角膜内皮细胞层的修复,且药物本身对内皮细胞无毒性。
 
五、结论
    重组人表皮生长因子衍生物滴眼剂在2500IU/ml、5000IU/ml和10000IU/ml剂量下,每天滴眼3次,连续三周,对兔碱烧伤角膜上皮的愈合有明显促进作用,在5000IU/ml和10000IU/m剂量的hEGF下可促进角膜内皮细胞的增殖和修复,且疗效明显优于素高捷疗,而药物本身对角膜上皮及内皮细胞无毒性作用,可望成为有效的角膜伤的治疗药物。
 
课题负责人:曾淑君(药理学教授), 彭大伟(眼科学教授)
实验负责人:余克明(眼科学博士)
实验参加者:余克明, 李勇(医学硕士), 伍宇平, 苏兴文,曾淑
            君
裂隙灯检查:中山眼科中心摄影室,杨华军(主管技师),雷少强(主
            管技师)
光镜检查: 中山眼科中心病理室,张洁(研究员),谢湖玲(副主
           任技师)
电镜检查:中山医科大学电镜实验室,吴义方(副主任技师)
角膜活细胞计数:中山眼科中心病理室,谢湖玲(副主任技师)
试验日期:1999,12
试验单位:中山医科大学药理教研室,中山眼科中心
原始资料保存:中山医科大学药理教研室
通讯地址:广州市 中山二路74号
邮政编码:510089
联系人:曾淑君
电话:87330578