表皮生长因子在眼表创伤愈合中的作用
表皮生长因子在眼表创伤愈合中的作用
刘扬 刘祖国
中山大学中山眼科中心
眼表的完整及角膜组织的创伤愈合需要细胞的增殖、分化、迁移与细胞凋亡过程保持精细的平衡。为实现这一平衡，一系列生长因子参与其中。表皮生长因子（epidermal growth factor, EGF）是上世纪六十年代Cohen等[1]在小鼠颌下腺中发现的一种生长调节蛋白，本文就EGF生长因子及其受体家族在眼表创伤愈合中的作用进行综述。
一、EGF生长因子及ErbB受体家族
1、EGF生长因子家族
EGF生长因子家族由大约11个成员组成，主要包括EGF，TGF-α(transforming growth factor-α), HB-EGF (heparin-binding EGF-like growth factor), AR (amphiregulin), BTC (betacellulin), EPR (epiregulin) 和EPI (epigen) [2-4]。这些生长因子均属于跨膜蛋白，以前体形式合成并存在。每一个生长因子的前体均由一个短的胞质端尾部、跨膜区及外功能区三部分组成（图1）。外功能区含有一个或多个EGF样结合域（EGF-like domain）,后者是生长因子家族成员的共性结构，EGF样结合域是含有6个半胱氨酸残基的由40～45个氨基酸残基构成的6KDa序列。除EGF外，其他成员均只含有一个6KDa的EGF样结合域。在蛋白水解酶的作用下，EGF家族前体释放出可溶性生长因子。EGF前体是这个家族中最大的成员[5]，约170kDa，裂解后产生150kDa的pro-EGF(含9个EGF样结合域，其中6个成熟的6kDa的EGF);pro-EGF再次水解后释放6个成熟的EGF分子。EGF生长因子家族中其他成员的前体也同样通过蛋白水解酶作用释放出外功能区的6kDa的序列，值得一提的是，EGF家族成员的前体形式，pro形式以及成熟形式都是具有生物学活性的[6]。
1988年，Tsutsumi等[7]首次发现EGF出现于小鼠的泪液中。之后，又有报道发现EGF可持续存在于人的泪液中[8,9]。泪腺是泪液中EGF家族成员的主要来源[10]，在小鼠与人的泪腺中均已检测到EGF 前体的mRNA[11,12]，通过对大鼠泪腺EGF mRNA水平和蛋白水平的检测发现泪腺中合成的只是152kDa的pro-EGF,而不是成熟的6kDa EGF[13]。目前人的泪液中已经证实存在的EGF家族成员有EGF及TGF-α, 但其分子量尚未明确，泪液中EGF的存在形式（6kDaEGF或150kDa pro-EGF）尚未确定[10,14]。
Darlene A. Dartt .Experimental Eye Research 78 (2004) 337–345
图1 EGF生长因子家族结构
2、ErbB受体家族
EGF生长因子家族的受体命名为ErbB受体，包括4种亚型：erbB-1(EGF受体，也称EGFR),erbB-2(也称Her-2和Neu),erbB-3和erbB-4。ErbB1-3均已证实表达于人的角膜、结膜上皮。ErbB受体由胞外的配体结合区，跨膜区，胞内区及一个含多个磷酸化位点的C－末端尾部构成。受体家族中的每一亚型都具有其配体特异性（表1），但目前尚未发现结合至ErbB-2的配体，现已发现，在大鼠泪腺及眼表上皮[15,16]，MUC4（唾液粘蛋白复合体）可与ErbB-2相结合形成ErbB2-MUC4复合体。与EGF家族成员类似，MUC4也是一种跨膜蛋白，包含2个EGF样结合域，而且也是通过ADAM或金属蛋白酶家族作用后释放胞外区。相应配体结合erbB受体后，erbB聚合形成同源或异源二聚体，激活erbB受体自身的酪氨酸激酶活性，对其蛋白质底物彻底磷酸化，启动信号转导。
Darlene A dartt. Exp Eye Res (2001)73.741-752
表1 EGF生长因子家族成员及其受体
二、EGF与眼表创伤愈合
创伤愈合是由上皮细胞及基质成纤维细胞的迁移、分裂、分化组成的一个使组织再生的过程。EGF通过促进细胞分裂迁移等多种作用参与眼表的创伤愈合。
1、EGF在眼表创伤愈合中的作用机制
体外实验表明EGF可抑制角膜上皮细胞终末分化，促进细胞增殖，在浓度高于0.1ng /ml时这种增殖作用呈剂量依赖性；另有研究表明当EGF浓度超过10ng /ml 时，其作用表现为抑制细胞的增殖[17,18]。应用基因芯片技术分析原代培养的人角膜上皮细胞的细胞周期及细胞分化相关基因，发现EGF促进上皮细胞分裂是通过细胞周期蛋白D1（cyclin D1）及丝/苏氨酸蛋白酶PITALRE等细胞周期调节基因的上调表达实现的[19]。体内实验大多认为，浓度为10－20μg /ml时，EGF可明显促进角膜损伤后的愈合。EGF也是有力的角膜上皮细胞迁移的刺激因子，体外实验中，在细胞密度较低的区域，EGF浓度在10-50ng /ml 之间时可加速角膜上皮细胞的迁移，其作用可被cAMP加强[20,21]。更为重要的是EGF可以促进细胞外基质成分的相互作用，促进上皮在纤维粘连蛋白表面的迁移。角膜创伤后，EGF可以上调并活化整合素β4,在角膜上皮迁移的过程中促进上皮与基质附着物的降解与再形成[23,24]。EGF对培养的角膜内皮细胞也具有刺激增殖作用，当浓度达到10ng/ ml时，对内皮细胞的增殖刺激作用进入平台期，增加细胞外基质分子后，其作用进一步加强[18,24]。Senoo等[25]研究发现，对于来源于50岁以上成人的角膜内皮细胞，EGF可以刺激其进入并完成细胞周期；对来源于30岁以下成人的角膜内皮细胞的细胞周期动力学影响较小。EGF对角膜基质细胞的作用较弱，这与角膜基质细胞中所分布的主要是低亲和力的EGF受体是一致的[18]。
在角膜创伤的修复过程中，EGF还可以刺激血管生成，促进创伤愈合。HB-EGF是近几年发现的血管生成刺激因子，可以以时间剂量依赖的方式刺激兔角膜新生血管的形成[26]。HB-EGF的促血管生成作用是通过促进内皮细胞的迁移及加强血管平滑肌细胞的VEGF的表达分泌实现的，与内皮细胞的增殖作用无关。
EGF的抗凋亡作用也参与创伤愈合过程。角膜基质创伤后最先观察到的反应是成纤维细胞的凋亡。体外实验表明EGF具有抗凋亡的作用，可激活角膜成纤维细胞PI3K，进一步活化AKT,从而抑制成纤维细胞凋亡，延长其存活时间[27]。早期凋亡过程开始后，EGF还可刺激角膜成纤维细胞的增殖，加速创伤愈合[28]。
2、EGFR相关的信号转导途径
角膜创伤后，泪腺EGFmRNA表达水平增加，进而分泌更多的EGF到泪液中[29]。伤后15-30分钟，EGFR可被活化，EGFR活化后可同时促进角膜缘上皮细胞的增殖，以及创伤区域周围分离的上皮细胞的迁移运动，从而促进创伤愈合[30]。EGFR的活化也激活了受体配体结合后的启动的EGF自分泌，参与创伤愈合过程。有关EGFR活化的真正起始信号，Block等[31]的研究认为，机械创伤后引起角膜上皮细胞迁移的真正诱因并不是创伤自身，而是突然中断的空间延续性。在由可移动的空间所诱导的上皮移动过程中，EGFR活化后的信号转导过程是必要的。HB-EGF是参与这一信号途径的主要配体；另外还存在使EGFR活化除HB-EGF以外的其他因子，其性质尚未明确。
在角膜创伤愈合过程中，EGFR配体以自分泌(autocrine)、旁分泌（paracrine,juxtacrine）方式激活EGFR相关信号转导途径[32]。自分泌是指配体作用于来源细胞表面的受体。当配体与细胞外基质相互作用或在组织间隙中弥散时，作用于其他细胞表面受体，这种方式称为旁分泌（paracrine）。旁分泌的概念由Anklesaria等[33]提出，角膜创伤诱导HB-EGF和/或TGF－α、AR通过胞外区脱落产生可溶性EGFR配体，后者进而活化细胞表面受体，这一作用过程称旁分泌（juxtacrine）（图2）。HB-EGF作为Ⅰ型跨膜蛋白通过酶解脱落释放出14－20kDa生长因子的过程，即为胞外区脱落，是角膜创伤愈合中自分泌－旁分泌（juxtacrine）刺激过程中的重要步骤，产生的可溶性HB-EGF对角膜上皮细胞具有强致分裂作用及化学趋化作用[34]。HB－EGF胞外区脱落释放可溶性HB-EGF以及EGFR磷酸化是角膜上皮创伤愈合过程中的起始信号[35]。
Amar B. Singh, Raymond C. Harris .Cellular Signalling 17 (2005) 1183 – 1193
图2 EGF自分泌(autocrine)、旁分泌（paracrine,juxtacrine）
Darlene A. Dartt .Experimental Eye Research 78 (2004) 337–345
图3 EGF信号途径
EGF受体介导的信号转导中有多种途径可以影响下游基因的表达（图3）。其中，PI3K和Erk1/2是两条已较为明确的信号转导途径。EGF与其受体（EGFR）结合形成二聚体后，可以活化酪氨酸激酶结构域并使受体自身磷酸化，磷脂酶C(PLC)连接到受体的磷酸酪氨酸结构域，并通过G蛋白使酪氨酸磷酸化被激活。在兔的角膜上皮细胞中，EGFR的激活可以导致PLC和磷脂酶D的激活。PLC被激活后可以将磷脂酰肌醇（PIP2）水解为2个有活性的片断――甘油二酯（DAG）和肌醇三磷酸(IP3)。另外，PLC活化可以激活PIP3激酶；同时，IP3和DAG也有利于蛋白激酶C（PKC）的激活。IP3可以使细胞外钙离子库释放，所以能激活钙离子依赖的钙调蛋白（CaM 激酶）和蛋白激酶C。DAG同时也能激活PKC。这样PKC就可促进MAP(mitogen-activated protein)激酶的活化进入MAPK途径[36]。在兔眼角膜上皮损伤的模型中，与损伤有关PI3K的活性及其表达水平出现短暂的上调，局部使用EGF可进一步提高PI3K的表达，加速上皮的愈合[37,38]。
另外一个与EGFR受体活化（如酪氨酸自身磷酸化）相关的信号转导过程涉及EGFR与Src蛋白的同源结构域的连接[36]。这样可激活Ras（GTP耦联蛋白），使细胞内信号转导进入MAPK途径。在这个途径的过程中，Raf（丝/苏氨酸蛋白酶超家族成员）是进入这个途径的关键点。Raf对生长、分化及凋亡相关的细胞因子的刺激发生反应，介导由受体控制的核转录事件。这个超家族成员中对生长因子刺激起初级反应的是细胞外信号反应激酶1和2（Erk-1和Erk-2），也可认为Raf家族涉及MAPKK（MAP-kinase-kinase-kinase）或MEKK及最终磷酸化作用的MAPK。MAPK有2种亚型p44 MAPK（Erk-1）和p42 MAPK (Erk-2）,在大部分细胞中都有表达。MAPK的作用底物包括核转录因子以及非核的底物如蛋白，丝/苏氨酸激酶p90sk和细胞骨架蛋白。EGF介导的核转录因子可使细胞周期G1期进入S期从而促进细胞增殖。另外一个MAPK活化的底物是磷脂酶A2（Cpla2），后者催化花生四烯酸从膜上的磷脂中释放，是前列腺素合成的限速步骤。PI3K和Erk1/2是EGFR信号途径中的两个效应子，角膜上皮损伤后，出现EGFR相关的两条途径的迅速激活，抑制任何一个途径均可导致角膜上皮愈合的延缓。最近的研究表明，角膜上皮创伤，非受体Src酪氨酸激酶活化，使HB－EGF释放，可溶性的HB-EGF结合至EGFR,启动胞内信号转导途径。通过PI3K,ERK途径使角膜上皮细胞迁移、增殖，使创伤愈合。但EGFR活化后，进一步激活Src酪氨酸激酶，参与至PI3K－AKT途径中，而不是ERK途径[39]。
在机械性上皮创伤后，创伤边缘细胞出现短暂Ca2+内流[40]。Ca2+是细胞受刺激后的一个重要的早期信使，这种Ca2+内流在上皮损伤后立即发生，并以波的形式传递至邻近细胞，2分钟内回复到基线水平， EGF可加强Ca2+流的强度和持续作用的时间。通过加强Ca2+的内流，EGF刺激角膜上皮细胞增殖。创伤后Ca2+内流主要通过膜通道蛋白TRPC4参与组成的胞膜SOC(store-operated channel )通道活化实现的。敲除TRPC4基因后，SOC通道活性及EGF诱导的Ca2+内流显著降低，上皮细胞的增殖减慢[41]。
三、重组人表皮生长因子（rhEGF）在眼表创伤愈合中的应用
1983年Urdea等[42]利用基因重组技术制备rhEGF获得成功，之后众多学者开展了rhEGF相关的基础研究与临床试验，使rhEGF应用于创伤愈合的治疗成为可能。
动物实验表明，rhEGF可以加速眼前段手术和创伤后的愈合过程。兔眼穿透性角膜移植术后，局部应用1000ng/滴的rhEGF滴眼液，连续应用两周后，与对照组相比，角膜组织强度增加600倍；术后3周进行角膜组织病理学检查可观察到所形成的瘢痕组织结构更为整齐；术后角膜组织散光程度也小于对照组，表明局部低剂量应用rhEGF可促进角膜组织的创伤愈合过程[43]。在兔前部角膜切除术后（切除直径8mm， 1/3厚度的角膜组织），局部应用1－10mg/ml rhEGF一周后，角膜组织的创伤愈合过程加速而且无不良反应发生，100mg/ml rhEGF则可引起角膜组织的炎症反应并促使角膜新生血管形成[44]。在兔眼的碱烧伤模型中，10－100mg/ml rhEGF每日4次连续应用32天后可加速角膜组织的愈合过程，但不能阻止病变的复燃[45]。也有研究认为rhEGF诱导碱烧伤后上皮增殖的最适浓度为5mg/ml[46]。体外实验观察到，rhEGF可促进培养的人结膜上皮细胞的增殖，其最适浓度为10－50mg/ml[47]。对于培养的内皮受损的人角膜组织，10ng/ml rhEGF可以促进内皮细胞迁移，加速愈合过程[48]。
大多数临床研究得到了与动物试验相似的结果，认为rhEGF可以安全有效地加速角膜组织的愈合过程。Ganem等[49]进行了随机双盲临床试验评价药物PHZ102（主要成分为rhEGF）在角膜上皮移植术后的角膜上皮重建中的作用，rhEGF组病人的重建时间为1－4天，明显短于安慰剂组的3－15天，认为rhEGF可缩短角膜上皮移植术后患者的角膜重建时间。将rhEGF眼液应用于穿透角膜移植术后的病人，不同的研究得到了不同的结论。Lin等[50]认为10－40μg/ml rhEGF均可以缩短术后移植片角膜上皮愈合时间，其最佳安全浓度为20μg/ml。而在Dellaert等[51]的研究中，比较30μg/ml、100μg/ml rhEGF及安慰剂对植片上皮的愈合作用时，结果表明30μg/ml rhEGF与安慰剂的作用并无显著性差异，而100μg/ml rhEGF使上皮愈合速度有所减缓，这种结果的出现可能与EGF受体位点的下调，所选用的rhEGF的浓度及作用时间有关。将rhEGF应用于单纯翼状胬肉切除及翼状胬肉切除联合羊膜移植术后的患者，这些患者角结膜上皮修复速度明显高于对照组[52,53]。rhEGF促血管生成方面的研究结论认为，小剂量（1mg以下）的rhEGF不会引起角膜新生血管的形成，但如果角膜缘新生血管形成过程已经启动，即使小剂量的rhEGF也可以加快新生血管的形成过程[54]。目前已有较多研究致力于寻求安全稳定长效的rhEGF递药系统。Kim等[55]制备了以泊洛沙姆（聚羟体，poloxamer）为附加剂的rhEGF/HP-β-CD复合体凝胶，与4。C保存的rhEGF相比，具有良好的物理化学稳定性，rhEGF可由复合体中持续释放，更长时间停留于眼表。
有些学者曾尝试将rhEGF应用于角膜植片保存液中，发现添加了rhEGF与胰岛素的保存液使植片内皮细胞的代谢活性发生改变，对于移植术后患者进行为期一年的随访，与对照组相比，植片清晰程度、内皮细胞数量、术后并发症（青光眼、植片排斥）的发生并无显著性差异[56,57]。
组织工程角膜是角膜创伤修复中对于角膜重建的另一种尝试。组织工程角膜的构建方法是将体外培养的角膜细胞和组织工程支架材料结合起来，形成角膜的等效物。组织工程角膜的体外细胞培养是角膜上皮细胞和内皮细胞的培养，其来源是人的正常角膜。生长因子对角膜细胞的培养、生长繁殖以及细胞外和细胞间基质的结合有明显的促进作用。其中，EGF可促进角膜细胞的增殖和迁移,对角膜的重建起着关键的作用[58]。组织工程角膜的良好上皮化是一个持续存在的难点，用EGF修饰支架材料以促进角膜上皮细胞生长是近年来一个新的尝试。Klenkler等[59]将PDMS支架材料暴露于不同浓度的rhEGF 与聚乙二醇（PEG）（不同比例）形成的溶液中，EGF通过相同的两个双功能PEG固定于胺化的硅胶表面，同未经修饰的支架材料相比，这种表面共价结合EGF的支架材料可明显促进角膜上皮细胞的覆盖。
rhEGF作为角膜创伤后的修复因子，目前其眼用制剂已应用于临床。进一步的研究工作仍需从分子水平探明EGF与细胞生长代谢的内在关系，以使其得到更好的利用。
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